L'iperplasia surrenale congenita (congenital adrenal hyperplasia - CAH) può essere causata da mutazioni in geni diversi. Nella maggior parte dei casi il gene mutato è CYP21A2 e la malattia si chiama allora deficit di 21-idrossilasi. Il deficit di 21-idrossilasi è alquanto frequente e le mutazioni del gene CYP21A2 sono causate in gran parte da eventi di conversione genica. Il gene CYP21A2 presenta infatti un elevato tasso di omologia di sequenza con il suo pseudogene CYP21A1P (il tasso di omologia arriva al 98% per la sequenza codificante e al 96% per la sequenza non codificante). Gene e pseudogene sono localizzati sullo stesso cromosoma vicino l'uno all'altro, separati dal gene C4B (vedi figura 1).
La conversione genica consiste prevalentemente in eventi di scambio unidirezionale di frammenti dello pseudogene che si innestano nel gene. Lo pseudogene contiene numerose mutazioni deleterie. Quando un pezzo di pseudogene si innesta nel gene (conversione genica) le mutazioni in esso contenute aboliscono la trascrizione del gene CYP21A2. Non è chiaro se tale innesto (o scambio unidirezionale che dir si voglia) avvenga in cis o trans (cioè fra copie del gene e dello pseudogene localizzate sullo stesso cromosoma o su cromosomi omologhi), ma da un punto di vista clinico ciò poco importa. È comunque importante sottolineare che, benchè frequente e paradigmatica, la conversione genica non è l'unico meccanismo biologico che porta alle mutazioni del gene CYP21A2. In effetti, grosse delezioni e duplicazioni (parziali o totali) di questo gene, per altro frequentmente riportate, non sono causate da eventi di conversione genica, ma da fenomeni di crossing-over ineguale alla meiosi fra copie di omologhi del gene CYP21A2. Ad esempio, il 20-30% delle mutazioni del gene CYP21A2 è rappresentato una grossa delezione che comprende l'estremità 3' dello pseudogene CYP21A1P, l'intero gene C4B e l'estemità 5' del gene CYP21A2. Questa delezione non è dovuta a conversione genica, ma a crossing-over ineguale alla meiosi.
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| Figura 1: rappresentazione schematica della localizzazione dello pseudogene CYP21A1P, del gene C4B e del gene CYP21A2 sul braccio corto del cromosoma 6 (6p). Copyright 2016 - Breda Genetics srl - tutti i diritti riservati. |
Pitfalls nel test genetico del deficit di 21-idrossilasi.
Data la complessità dei processi mutazionali del gene CYP21A2 l'analisi genetica di laboratorio presenta alcune difficoltà, sia tecniche sia interpretative. Analizziamo subito le seconde, che possono essere particolarmente insidiose soprattutto nei casi in cui viene richiesto il test del portatore. In effetti va subito ricordato che un paziente può essere asintomatico, ma comunque affetto dalla forma non classica della malattia. In tal caso, il soggetto avrà il gene mutato su entrambi i cromosomi. Tuttavia, anche nei portatori sani è possibile rilevare due o più mutazioni malattia. Ciò è dovuto proprio alla conversione genica: lo pseudogene contiene numerose mutazioni lungo tutta la sua sequenza e un evento di conversione genica (che comporta l'inserzione di una frammento più o meno grosso dello pseudogene nel gene) può portare al trasferimento di più di una mutazione deleteria nella sequenza del gene. Per questo motivo, ogni volta che si rilevino due o più mutazioni del gene CYP21A2, è strettamente raccomandato eseguire l'analisi dei genitori del probando (o, se non disponibili, almeno dei fratelli) per cercare di capire se le due mutazioni sono in trans (cioè su due cromosomi diversi, configurando quindi una diagnosi genetica di deficit di 21-idrossilasi) o in cis (cioè su uno stesso cromosoma, configurando quindi una diagnosi di semplice portatore sano). Qualora l'analisi parentale dimostri che le due mutazioni sono sullo stesso cromosoma (in cis) è chiaro che il soggetto è un portatore sano e che le due mutazioni sono la conseguenza di un evento di conversione genica fra CYP21A2 e CYP21A1P. Una piccola ma importante informazione in più sul test del portatore di 21-idrossilasi: il test biochimico tramite dosaggio ormonale del 17-OHP (17-idrossiprogesterone) non è affidabile per l'identificazione dei portatori sani. Anche se è vero, infatti, che i portatori sani di deficit di 21-idrossilasi possono mostrare livelli lievemente aumentati di 17-OHP, sussiste in generale una certa sovrapposizione fra i valori di 17-OHP nei portatori sani e nei sani non-portatori. A causa di questa frequente sovrapposizione il dosaggio ormonale non è diagnostico e il test genetico rimane dunque l'unico strumento disponibile per l'identificazione dei portatori sani del deficit di 21-idrossilasi.
Un'altra fonte di errore intepretativo del risultato del test può essere causata dalla presenza di duplicazioni del gene. Esistono infatti soggetti che recano una copia "sana" del gene CYP21A2 insieme a una copia duplicata (sullo stesso cromosoma) che reca la mutazione p.Gln319*. In questo caso l'individuo può essere erroneamente classificato come portatore sano, ma in realtà non è portatore, perché la copia "sana" del gene rimedia alla presenza della copia duplicata e mutata.
Un ulteriore aiuto all'interpretazione del risultato del test genetico per deficit di 21-idrossilasi può venire dal sito dedicato alla nomeclatura delle mutazioni del gene CYP21A2: CYP21A2 Allele Nomenclature.
Conversione genica e pseudogeni in generale
Conversione genica e pseudogeni in generale
La
conversione genica è la causa più frequente di mutazione del gene
CYP21A2, ma può verificarsi anche in altri geni. Stranamente, tuttavia,
la conversione genica non sembra aver luogo ovunque esistano pseudogeni.
Il gene PKD1, ad esempio, ha ben 6 pseudogeni, tutti con un elevato
grado di omologia di sequenza. Tuttavia la conversione genica non sembra
essere una causa di mutazione patogena del gene PKD1 (anche se studi
recenti sembrano identificare proprio in eventi filogenetici di
conversione genica la causa per la quale l'uomo possiede così tanti
pseudogeni di PKD1, a differenza di altri organismi come il topo, ad
esempio, che non ha nemmeno uno). È dunque evidente che altri fattori
devono intervenire affinché si verifichi un evento di conversione genica
e che la mera esistenza di pseudogeni non è un requisito unico o
sufficiente. Sappiamo ad esempio che i trasposoni favoriscono il
movimento di pezzi del genoma. È quindi possibile che elementi
(retro)trasposti favoriscano la conversione genica. Anche la presenza di
sequenze altamente ripetute (dupliconi) potrebbe indurre la conversione
genica favorendo (come è già noto) la ricombinazione allelica fra non
omologhi (NHAR: non homologous allelic recombination).
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