SEQUENCING LIBRARY: COSA È?

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Fondamentale per tutte le reazioni di Next Generation Sequencing è la preparazione della cosiddetta sequencing library (libreria di sequenziamento). Esistono diversi modi di preparare una sequencing library, a seconda del tipo di piattaforma che si desidera utilizzare (Life Technologies, Illumina, Roche e Pacific Biosciences sono le piattaforme NGS più diffuse).

Le librerie possono essere di DNA o di RNA, a seconda che si desideri svolgere analisi di genomica o trascrittomica. I tre step fondamentali nella preparazione di una sequencing library di DNA sono:

1) frammentazione e dimensionamento del campione ad una lunghezza predefinita

2) aggancio degli adattatori (adapters) alle estremità dei frammenti ottenuti

3) quantificazione della libreria ottenuta

Nella preparazione delle sequencing library a partire da RNA è presente uno step ulteriore, che è quello della conversione dell'RNA in una molecola di cDNA. In questo caso, la frammentazione può avvenire prima o dopo la sintesi del cDNA.

La frammentazione dell'acido nucleico può essere fatta con metodi fisici (frammentazione acustica e sonicazione), enzimatici (tramite l'uso di endonucleasi aspecifiche come la DNase I o la Fragmentase o kit enzimatici commmerciali come il Nextera tagmentation kit di Illumina, il quale, fra l'altro, non solo frammenta il DNA, ma procede all'immediato aggancio degli adattori tramite una trasposasi) o chimici. Per la frammentazione del DNA si utilizza solitamente il metodo fisico o enzimatico (Covaris, ad esempio, è uno strumento utilizzato per la frammentazione acustica).

La dimensione dei frammenti da ottenere è un parametro chiave. Essa dipende sia dalla piattaforma che si intende utilizzare sia dallo scopo dell'analisi. Ad esempio, nel sistema Illumina si possono ottenere buoni risultati con frammenti fino a 1500 paia di basi (1500bp) di lunghezza. Tuttavia, nel caso in cui si desideri procedere al sequenziamento di un esoma, è raccomandabile creare delle sequencing library con inserti (così si chiama tecnicamente il frammento di DNA una volta che gli adattori sono stati agganciati alle sue estremità) non più lunghi di 200-250bp. Questo semplicemente perché la dimensione media di un esone umano è di 200bp.

Subito dopo la fase di frammentazione si passa alla fase di aggiunta degli adattori, seguita da un ulteriore step di dimensionamento (sizing) nel quale si rimuovono tutti i frammenti di lunghezza non desiderata e tutti i dimeri di adattori (cioè i dimeri che gli adattori in eccesso hanno formato legandosi fra di loro. È bene ricodare che i dimeri di adattatori possono ridurre sensibilmente la resa della reazione di sequenziamento e che sono particolarmente abbondanti laddove la quantità di DNA iniziale sia particoolarmente bassa.

Per saperne di più: Libri e Pubblicazioni sulla Next Generation Sequencing

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