DIAGNOSI GENETICA DELL'ATASSIA SPINOCEREBELLARE

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La diagnosi genetica dell'atassia spinocerebellare è basata sostanzialmente su tre metodiche diverse: l'analisi di lunghezza di frammenti (fragment length analysis - FLA), il sequenziamento diretto (tramite Sanger sequencing o Next Generation Sequencing - NGS) e l'analisi di delezione/duplicazione.

ANALISI DI FRAMMENTI DI LUNGHEZZA (FRAGMENT LENGTH ANALYSIS)

Molti dei sottotipi genetici di atassia spinocerebellare a trasmissione autosomica dominante sono causati dall'espansione di ripetizioni in geni specifici. Lo screening delle regioni ripetute viene di solito fatto tramite l'analisi di lunghezza (in inglese fragment length analysis - FLA). La regione contente la ripetizione viene cioè amplificata tramite PCR e gli amplificati vengono successivamente fatti correre in elettroforesi capillare su un sequenziatore Sanger. La metodica è relativamente semplice e poco costosa. È tuttavia necessario che l'interpretazione del tracciato venga fatta da un operatore esperto. In effetti vi sono alcune piccole trappole da tenere presente. Prima fra tutte: alleli con espansioni particolarmente estese possono non essere amplificati in PCR proprio a causa delle loro grosse dimensioni. In questo caso i primer della PCR si legano solo all'allele non espanso (normale) e il tracciato finale darà quindi un falso responso di omozigosi per l'allele normale (il paziente potrebbe cioè essere erroneamente diagnostico come non affetto da qual particolare sottotipo genetico di SCA perché risultato omozigote per un allele normale). Ne consegue che per tutti quei sottotipi genetici di SCA nei quali è possibile la presenza di un allele estremamente espanso è necessario eseguire, in caso di risultato omozigote, un ulteriore analisi genetica. In particolare, a seconda dell'attrezzatura e dei protocolli a disposizione, si può eseguire il Southern blot o il repeat primer assay (RPA). Entrambe le metodiche consentono di chiarire se il paziente è realmente omozigote o se reca un allele normale non espanso e uno patolgicamente espanso e permettono perciò di escludere o confermare definitivamente la diagnosi dello specifico sottotipo genetico di SCA.

SEQUENZIAMENTO

Molte forme genetiche di SCA possono essere causate da mutazioni puntiformi di singolo nucleotide o da piccole delezioni o inserzioni di pochi nucleotidi. Questo tipo di mutazioni è identificabile tramite il sequenziamento. Il sequenziamento (sia che sia fatto tramite il tradizionale Sanger sequencing o tramite la Next Generation Sequencing) presenta valori di specificità e sensibilità piuttosto elevati. In altri termini, se il paziente è portatore di una mutazione nella regione codificante o al confine esone/introne, tale mutazione sarà quasi sicuramente rilevata dal sequenziamento. Tuttavia, poiché il sequenziamento di routine viene di solito fatto solo per la regione codificante, mutazioni localizzate in regioni introniche profonde (che potrebbero affliggere una minoranza di pazienti) non possono essere rilevate dalla metodica.

ANALISI DI DELEZIONE/DUPLICAZIONE

Negli stessi geni in cui è possibile identificare mutazioni puntiformi tramite il sequenziamento è alle volte possibile identificare anche grandi delezioni o duplicazioni di parte o dell'intero gene. Tali delezioni o duplicazioni sono presenti allo stato eterozigote nelle forme a trasmissione autosomica dominante e solitamente allo stato omozigote nelle forme a trasmissione autosomica recessiva. Una grande delezione omozigote può solitamente essere sospettata dal fallimento dell'amplificazione (PCR) prima del sequenziamento, ma una grande duplicazione omozigote o una grande delezione o duplicazione allo stato eterozigote non sono identificabili al sequenziamento. Un esempio eccellente è rappresentato dal gene ITPR1, le cui mutazioni causano i sottotipi autosomici dominanti SCA15 e SCA29. Nel gene ITPR1 tutte le mutazioni descritte fino ad ora sono grandi delezioni eterozigoti non rilevabili al sequenziamento (con l'eccezione di pochissime famiglie nelle quali sono state identificate mutazioni puntiformi). Ne consegue che il sequenziamento non è affatto la metodica di elezione per il primo approccio diagnostico al paziente con sospetta SCA15 o SCA29.

Per identificare grandi delezioni o duplicazioni è necessario procedere ad analisi specifiche. In particolare, si ricorre alla multiplex ligation probe amplification (MLPA) o alla PCR quantitativa (qPCR). Quando il kit commerciale sia disponibile (MRC-Holland) si può fare l'MLPA. Laddove il kit commerciale MLPA non sia disponibile, il laboratorio sufficientemente attrezzato potrà disegnare la qPCR specifica.