Quando analizzare un singolo gene e quando preferire l'analisi di un gruppo di geni in parallelo (pannello)?
La domanda ha senso sì e no, poiché il problema spesso non si pone nemmeno (se non per ragioni di tipo economico che, con l'avvento della Next Generation Sequencing - NGS, sono comunque sempre meno rilevanti). La scelta fra l'analisi di un singolo gene o di un pannello di geni dipende (1) dal sospetto clinico e (2) dalla genetica della malattia sospettata.
Si prenda, ad esempio, il caso di un paziente affetto da mucopolisaccaridosi di tipo I (MPS I) la cui diagnosi sia già stata confermata dal dosaggio biochimico dell'enzima α-L-iduronidasi. La MPS I, che si trasmette con modalità autosomica recessiva, è causata da mutazioni del gene IDUA. La MPS I non può essere in nessun caso causata da mutazioni in altri geni. Ne consegue che testare altri geni all'infuori di IDUA non avrebbe alcun senso. L'analisi di singolo gene rappresenta dunque l'unica indicazione in un paziente di questo tipo.
Si prenda invece in considerazione il caso di un paziente con un forte sospetto clinico di miopatia nemalinica (nemaline myopathy - NM). La miopatia nemalinica è una patologia caratterizzata da ampia variabilità clinica, in particolare per quanto riguarda la gravità dei sintomi, il coinvolgimento respiratorio e l'età d'esordio (che può essere sia congenito, che nell'infanzia o addirittura nell'età adulta). La patologia si caratterizza per debolezza e ipotonia muscolare (maggiormente evidenti al viso, al collo e alla parte prossimale degli arti) e per i riflessi tendinei ridotti o assenti. La miopatia nemalinica, che può essere trasmessa con modalità autosomica dominante o recessiva, è inolte caratterizzata da ampia eterogenità genetica, poiché può essere causata da mutazioni in uno fra un gruppo di geni noti. Fino ad ora sono state identificate mutazioni nei geni ACTA1, NEB, TPM3, TPM2, TNNT1, CFL2, KBTBD13, e KLHL40. Tuttavia, poichè mutazioni in questi geni sono identificabili solo in una minoranza di pazienti, è assai verosmile che mutazioni anche in altri geni possano causare la malattia. Per la miopatia nemalinica è stato possibile delineare alcune correlazioni genotipo-fenotipo. Si sa, ad esempio, che le mutazioni del gene NEB sono invariabilmente associate alla tramissione autosomica recessiva e che si trovano più comunemente in pazienti affetti dalla forma congenita, mentre la forma ad esordio infantile può essere correlata a mutazioni nei geni TPM3 o ACTA1. È tuttavia noto che la sovrapposizione clinica fra i vari sottotipi genetici della malattia è molto estesa e non è quindi possibile fare a priori una scelta mirata per uno, due o tre geni in particolare da analizzare. Nemmeno l'analisi istologica della biopsia muscolare (vedi Figura 2) è di aiuto, poiché, pur potento confermare la diagnosi, non da alcuna indicazione su quale sia il gene mutato.
In un caso di sospetta miopatia nemalinica è quindi indicato procedere subito all'analisi del pannello comprendente tutti i geni noti fino ad ora. Oramai quasi tutti i laboratori offrono, per questo tipo di analisi, pannelli NGS che presentano notevoli vantaggi in termini di costi e rapidità d'esecuzione (un buon laboratorio può fornire il risultato di un pannello completo in un paio di settimane). Una curiosità interessante riguarda le dimensioni del gene NEB, che codifica per la nebulina. Il gene NEB è da sempre noto per essere uno dei più grandi di tutto il genoma umano, comprendendo ben 183 esoni ed estendensosi per circa 250.000 basi (250 kb). Prima dell'avvento della NGS, l'analisi della regione codificante del gene NEB tramite Sanger sequencing era estremamente dispendiosa e, in quanto tale, offerta solo da pochi centri. Grazie alla NGS, l'analisi di questo gene è diventata assai più accessibile. Per via delle grandi dimensioni del gene, l'analisi NGS risulta conveniente anche per NEB soltanto (analisi NGS per piccoli geni non sono economicamente valide a causa dei costi di base della corsa). In effetti, le richieste di analisi del solo gene NEB non sono rare, poiché in passato, a causa dei costi elevati, il test genetico veniva eseguito per tutti gli altri geni ma non per NEB. È comunque giusto tener presente che un'analisi completa del gene NEB dovrebbe incledere, soprattutto nel caso in cui non si riesca ad identificare la seconda mutazione, anche il test di delezione/duplicazione. Attualmente l'analisi di delezione/duplicazione del gene NEB è disponibile solo tramite qPCR e, in genere, è limitata solo ad alcune parti del gene (in effetti un'analisi di delezione/duplicazione completa richiederebbe quasi un amplicone per esone, con costi a tuttoggi quasi proibitivi).
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La domanda ha senso sì e no, poiché il problema spesso non si pone nemmeno (se non per ragioni di tipo economico che, con l'avvento della Next Generation Sequencing - NGS, sono comunque sempre meno rilevanti). La scelta fra l'analisi di un singolo gene o di un pannello di geni dipende (1) dal sospetto clinico e (2) dalla genetica della malattia sospettata.
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| Figura 1: la sindrome di Dravet è nota per essere causata da mutazioni nel gene SCN1A. Tuttavia, anche mutazioni nel gene GABRG2 e, secondo alcuni, nel gene SCN2A possono causare la sindrome. Anche le mutazioni di un quarto gene, SCN9A, potrebbero forse causare la sindrome. Tuttavia non è ancora chiaro se le mutazioni di SCN9A possano semplicemente fungere da fattori di modulazione del fenotipo piuttosto che da mutazioni-malattia vere e proprie, poichè alcuni pazienti presentano mutazioni solo in questo gene, ma altri recano mutazioni sia in SCN9A che in SCN1A © 2016 Breda Genetics srl. |
Si prenda invece in considerazione il caso di un paziente con un forte sospetto clinico di miopatia nemalinica (nemaline myopathy - NM). La miopatia nemalinica è una patologia caratterizzata da ampia variabilità clinica, in particolare per quanto riguarda la gravità dei sintomi, il coinvolgimento respiratorio e l'età d'esordio (che può essere sia congenito, che nell'infanzia o addirittura nell'età adulta). La patologia si caratterizza per debolezza e ipotonia muscolare (maggiormente evidenti al viso, al collo e alla parte prossimale degli arti) e per i riflessi tendinei ridotti o assenti. La miopatia nemalinica, che può essere trasmessa con modalità autosomica dominante o recessiva, è inolte caratterizzata da ampia eterogenità genetica, poiché può essere causata da mutazioni in uno fra un gruppo di geni noti. Fino ad ora sono state identificate mutazioni nei geni ACTA1, NEB, TPM3, TPM2, TNNT1, CFL2, KBTBD13, e KLHL40. Tuttavia, poichè mutazioni in questi geni sono identificabili solo in una minoranza di pazienti, è assai verosmile che mutazioni anche in altri geni possano causare la malattia. Per la miopatia nemalinica è stato possibile delineare alcune correlazioni genotipo-fenotipo. Si sa, ad esempio, che le mutazioni del gene NEB sono invariabilmente associate alla tramissione autosomica recessiva e che si trovano più comunemente in pazienti affetti dalla forma congenita, mentre la forma ad esordio infantile può essere correlata a mutazioni nei geni TPM3 o ACTA1. È tuttavia noto che la sovrapposizione clinica fra i vari sottotipi genetici della malattia è molto estesa e non è quindi possibile fare a priori una scelta mirata per uno, due o tre geni in particolare da analizzare. Nemmeno l'analisi istologica della biopsia muscolare (vedi Figura 2) è di aiuto, poiché, pur potento confermare la diagnosi, non da alcuna indicazione su quale sia il gene mutato.
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| Figura 2: rappresentazione schematica di biopsia con fibre muscolari in sezione contenenti corpi nemalinici (detti anche bastoncelli nemalinici - nemaline rods) - colorazione tricromica di Gomori. © 2013 lezionidigenetica.blogspot.com. |
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