LA TECNOLOGIA NGS DI ILLUMINA (SPIEGATA CON UN SALTO NEL PASSATO)

Le piattaforme NGS di Illumina sono basate su un sistema che era stato originariamente ideato e messo a punto da Solexia, azienda acquistata da Illumina nel 2007. Il primo sequenziatore prodotto da Solexia si chiamava Genome Analyzer (GA). Illumina ne proseguì la produzione, lanciando successivamente il Genome Analyzer IIx. Oggi la serie Genome Analyzer è fuori produzione, avendo ceduto il passo alle nuove, più potenti macchine della casa. Per aggiornamenti sulle nuove serie di sequenziatori oggi prodotti da Illumina (HiSeq, NextSeq e MiSeq) potete leggere qui.

MACCHINE PER L'EXOME SEQUENCING: ILLUMINA

La regione codificante (cioè la parte del DNA che codifica per le proteine, comunemente detta anche esoma) rappresenta solo il 2% di tutto il genoma umano, ma ben l'85% delle mutazioni-malattia cadono proprio in questa regione. Il sequenziamento dell'esoma (exome sequencing) è dunque una tecnica d'elezione per lo studio delle malattie genetiche, specialmente laddove il gene associato alla malattia non sia ancora stato identificato (leggi anche l'articolo specifico sull'exome sequencing).

SEQUENZIAMENTO CON NANOBALLS

Nelle nostre review sui più moderni sistemi di sequenziamento abbiamo parlato di Illumina, Life Technologies, Roche, Pacbio RS e SOLiD. È ora il momento di parlare della tecnologia di Complete Genomics, una compagnia di Mountain View (California) che è stata acquisita nel marzo 2013 dal gigante cinese dei servizi di sequenziamento, la BGI-Shenzen.

HIGH-THROUGHPUT SEQUENCING

Spessissimo si sente parlare di high-throughput sequencing, ossia di sequenziamento ad alta resa. High-throughput sequencing è un termine molto diffuso per identificare le moderne metodiche di Next GenerationSequencing (NGS), che consentono di analizzare un'elevatissima quantità di sequenze (anche di soggetti diversi in parallelo) in breve tempo e a costi relativamente contenuti. La high-throughput sequencing rappresenta l'evoluzione del metodo di sequenziamento più tradizionale, il cosiddetto Sanger sequencing, a volte più preciso, ma decisamente più lento e molto più costoso. Se l'output giornaliero di un sequenziatore capillare con tecnica Sanger è nell'ordine delle migliaia di basi, l'output delle macchine di high-throughput sequencing è nell'ordine delle gigabasi.

Con la NGS è possibile analizzare sia DNA che RNA. Tipiche analisi di high-throughput sequencing sono l'exome sequencing e il genome sequencing. Dopo aver conquistato il dominio della ricerca, grazie al supporto di strumenti di analisi bioinformatica sempre più complessi e più precisi, la high-throughput sequencing si sta espandendo sempre di più anche nella diagnostica di routine.

Per saperne di più:

• NEXT GENERATION SEQUENCING  
• ANALISI BIOINFORMATICA: LA VERA SFIDA DEL FUTURO  
• APPLICAZIONI DELLA NEXT GENERATION SEQUENCING  
• PERSONAL GENOME MACHINES: IL MOMENTO È ARRIVATO!  
• EXOME SEQUENCING  
• GENOME SEQUENCING  
• SANGERSEQUENCING: LA STORIA COMINCIA DA QUI

SINDROME DI ANGELMAN: ITER DIAGNOSTICO

Come si fa a confermare la diagnosi genetica di sindrome di Angelman?

La diagnosi genetica della sindrome di Angelman richiede non di rado l'esecuzione di un'analisi a più livelli. Andando con ordine i test più indicati sono:

TECNOLOGIA DI SEQUENZIAMENTO NANOPORE (SEQUENZIAMENTO DI TERZA GENERAZIONE)

I prototipi con tecnologia nanopore sono basati sull'elettroforesi di DNA/RNA attraverso pori di dimensioni piccolissime (nanopori). Questa tecnologia di sequenziamento di terza generazione consentirebbe di sequenziare le molecole di DNA/RNA originali (senza ricorrere cioè al sequencing-by-synthesis). Si suppone che sia possibile ottenere reads lunghissime, addirittura nell'ordine di milioni di basi se non di più, partendo per altro da quantità estremamente contenute di DNA/RNA. Anche in questo caso, come nel sistema SMDS/DRS, è possibile sequenziare direttamente l'RNA senza retrotrascriverlo in cDNA. Sono molti i gruppi di ingegneri e ricercatori che, sia nel privato che nell'accademia, stanno sviluppando sistemi basati sulla tecnologia nanopore, tuttavia nessun dispositivo è per ora disponibile sul mercato.

SINGLE MOLECULE DNA SEQUENCING (SMDS) E DIRECT RNA SEQUENCING

Si tratta del primo sistema third generation sequencing arrivato sul mercato. Questa piattaforma, lanciata da Helicos Biosciences, consente il sequenziamento di molecole originali di DNA/RNA senza step di manipolazione delle molecole. Le molecole di RNA possono essere sequenziat direttamente, anche senza essere preventivamente retrotrascritte in cDNA. La metodica è basata sul principio del sequencing-by-synthesis. Il sistema è in grado di funzionare con bassissime quantità di DNA/RNA (400-1000 attomoli), non produce errori nelle zone ricche in CG ed è efficace anche su campioni estratti da paraffina. Il sistema tuttavia presenta alcune limitazioni, principalmente legate alla lunghezza ridotta delle reads (fino a 55 nucleotidi solamente) e al tasso di errore pari al 3-4%, che ne hanno limitato il successo commerciale.

THIRD GENERATION SEQUENCING: LA SOLUZIONE ALLE LIMITAZIONI DELLA NGS

Dopo i primi sequenziamenti su gel di poliacrilamide la prima, vera grande rivoluzione fu quella del sequenziamento tramite elettroforesi capillare. Si trattava in entrambi i casi di sequenziamento Sanger, ossia di una metodica sequencing-by-synthesis con terminatori di catena (l'elettroforesi capillare è ancor oggi usatissima nella diagnostica di routine) . Il secondo grande balzo fu fatto con la Next Generation Sequencing (NGS, anche nota come second generation sequencing), approdata sul mercato per la prima volta nel 2005 con la piattaforma Roche/454, seguita nel 2006 dal sistema Illumina/Solexa, nel 2007 dal sistema SOLiD di Applied Biosystems, nel 2008 da Complete Genomics e nel 2010 dalle personal genome manchines (Ion Torrent e MiSeq). Con la NGS si può sequenziare un intero genoma umano con capture 30x per meno di 4000 EUR in circa 8 giorni. Una vera conquista, ma con risultati ancora lontani dal sistema perfetto come molti se lo immaginano (e come verosimilmente dovrà essere). Ed è per questo che, pur essendo la NGS una metodica ormai standardizzata e certificata, la ricerca è ora protesa allo sviluppo di sequenziatori cosiddetti di terza generazione (Third Generation Sequencing).

THE RARE CFTR MUTATION Y301C

CFTR is a well-known gene, of which mutations have been extensively characterized. However, some very rare mutations of this gene are still missing a clear understanding of their real clinical significance. This is the case, for instance, of the mutation c.902A>G (p.Y301C), detectable in exon 8. This is a very rare mutation, with limited data about its phenotypic effect. The mutation was firstly reported by Constantinou-Deltas CD et al. in a study on the Cyprus population (Hum Mutat 1992; 1:503-5). Another report about this mutation is by Castellani C et al (PMID: 9915972): the authors found this mutation also in compound heterozygosity with a second mutation in neonates with normal sweat chloride test but with hypertrypsinemia, stating that the diagnosis of cystic fibrosis in these patients remained a moot point. According to the Italian Foundation for Research on Cystic Fibrosis (http://www.fibrosicisticaricerca.it/Fibrosi-Cistica/Domande-e-risposte/Mutazione-Y301C), this mutation has been described in patients with altered sweat test who showed atypical signs of the disease, like respiratory and pancreatic symptoms. It is very important to note that the phenotypic effect of any CFTR mutation is depending on the type of the mutation itself (severe or mild) and on the genotypic combination possibilities between severe and mild mutations. Thus, when this mutation is found in an unaffected person, it may be appropriate to define this individual as being carrier of a CFTR pathogenic mutation of which phenotypic effect remains poorly defined.

LA RARA MUTAZIONE Y301C NEL GENE CFTR

Il gene CFTR, insieme a tutte le sue varianti e alle sue mutazioni, è stato caratterizzato in modo esteso e dettagliato. Tuttavia, in alcuni rari casi, certe sue varianti sembrano restare di significato incerto. È il caso, ad esempio, della variante c.902A>G (p.Y301C), localizzabile nell'esone 8. Si tratta si una variante molto rara, con dati molto limitati circa il suo possibile effetto fenotipico. Questa mutazione è stata riportata per la prima volta da Constantinou-Deltas CD et al. in uno studio sulla popolazione di Cipro (Hum Mutat 1992; 1:503-5). Un altro report su questa variante è stato pubblicato ad opera di Castellani C et al (PMID: 9915972): identificando questa mutazione anche in eterozigosi composta con una seconda mutazione in neonati che presentavano test del sudore normale ma ipertripsinemia, gli autori considerano quantomeno controversa una diagnosi di fibrosi cistica in casi del genere. Secondo la Fondazione Italiana di Ricerca sulla Fibrosi Cistica (http://www.fibrosicisticaricerca.it/Fibrosi-Cistica/Domande-e-risposte/Mutazione-Y301C), la variante c.902A>G (p.Y301C) è stata descritta in pazienti con test del sudore alterato e segni di malattia atipici (di tipo respiratorio e pancreatico). È molto importante ricordare che l'effetto fentipico di qualsiasi mutazione CFTR dipende sia dal tipo di mutazione, lieve o grave, sia dalla combinazione genotipica delle mutazioni. In conclusione, quando la mutazione c.902A>G (p.Y301C) viene idenitificata in un soggetto non affetto da fibrosi cistica, sembra lecito dire che tale soggetto è portatore di una mutazione patogenica il cui effetto fenotipico rimane poco chiaro.

qPCR/RT-PCR: PRINCIPI DI FUNZIONAMENTO E MACCHINARI

La qPCR (acronimo che sta per quantitative PCR, altresì nota anche come RT-PCR, realt-time PCR, o qrtPCR - quantitative real-time PCR) è una reazione di polimerizzazione a catena nella quale il DNA viene non solo amplificato, ma anche quantificato. Le applicazioni principali della qPCR sono la genotipizzazione (ossia l'analisi del DNA per la caratterizzazione degli alleli a determinati locus), gli studi di espressione (ossia l'analisi del cDNA, ottenuto dalla retrotrascrizione dell'RNA) e l'analisi dei pattern di metilazione.

EST (EXPRESSED SEQUENCE TAG)

Le Expressed Sequence Tag (EST) sono dei piccoli frammenti di 200-800 bp che si ottengono dal sequenziamento del cDNA. Dunque una EST non è altro che una read. Fin dal 1991 le EST (al plurale spesso identificate come ESTs) hanno avuto un ruolo fondamentale nel sequenziamento della parte codificante del genoma umano.

PACBIO RS II: READS FINO A 30.000 NUCLEOTIDI

Abbiamo già visto nell'articolo IL FUTURO DELL'ANALISI BIOINFORMATICA come una delle sfide maggiori nella progettazione del sequenziatore ideale sia quella di riuscire a produrre reads di lunghezza sempre maggiore. In questo senso, PacBio RS II sembra essere sulla strada giusta. PacBio RS è un sistema di Third Generation Sequencing e si propone come alternativa a Ion Torrent, Illumina e Roche. Mentre la lunghezza delle reads ottenibili con gli ultimi due non supera le centinaia di nucleotidi, PacBio RS II può produrre reads con una lunghezza media che va da 4.200 a 8.500 bp, fino ad un massimo di 30.000 bp.

MATE PAIR SEQUENCING

Il sequenziamento NGS mate pair, detto anche mate pair sequencing, è un'applicazione efficace per la rilevazione di riarrangiamenti cromosomici nell'ordine delle centinaia di nucleotidi.

CONSIDERAZIONI SULLA PREPARAZIONE DI UNA SEQUENCING LIBRARY: COMPLESSITÀ, ERRORI ED EFFETTI GRUPPO (BATCH EFFECTS)

Ogni qualvolta si prepara una sequencing library le precoccupazioni principali sono: 1) ottenere un livello di complessità adeguato (vedi sotto), 2) ridurre al minimo gli errori e i bacth effects. Ma andiamo con ordine.

SEQUENCING LIBRARY: COSA È?

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Fondamentale per tutte le reazioni di Next Generation Sequencing è la preparazione della cosiddetta sequencing library (libreria di sequenziamento). Esistono diversi modi di preparare una sequencing library, a seconda del tipo di piattaforma che si desidera utilizzare (Life Technologies, Illumina, Roche e Pacific Biosciences sono le piattaforme NGS più diffuse).

MiSeq E OVERLAPPING PAIRED-END READS

Abbiamo visto come nel sequenziamento a paired-end reads le reads ottenute a partire dalle due estremità dei frammenti della sequencing library non siano né complementari né sovrapponibili, ma restino separati da un tratto di sequenza di DNA dalla grandezza nota, definito in gergo inner mate distance. Nel sistema MiSeq di Illumina, tuttavia, la inner mate distance può essere negativa, poiché in questo sistema le paired-end reads possono sovrapporsi.

SINGLE-END READS E PAIRED-END READS

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Un sequenziamento NGS può essere fatto utilizzando single-end reads o paired-end reads. Come già visto nella lezione COSA È UNA READ?, una read è una corta sequenza di DNA di sintesi che viene prodotta durante la reazione di sequenziamento.

COS' È UNA READ?

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Sequenziamento: cosa sono le reads? Solo apparentemente complesso, il concetto di read può essere spiegato facilmente.

Una read è una piccola sequenza di DNA di sintesi che si ottiene in una reazione di sequenziamento. Il sequenziamento può essere fatto essenzialmente seguendo uno dei seguenti due principi: (1) chromosome walking: la reazione procede in modo ordinato lungo il cromosoma, (2) shotgun sequencing: vengono amplificati e sequenziati pezzi a caso del genoma, che vongono poi riallineati con operazioni di alignment.

IL FUTURO DELL'ANALISI BIOINFORMATICA

Vista la sempre crescente capacità di output dei sequenziatori (che arriva ormai ai miliardi di basi a corsa), abbiamo già detto come una delle maggiori sfide del futuro sia costituita dall'analisi bioinformatica. L'enorme potenza di calcolo richiesta costringe già oggi a dover scegliere, in alcuni casi, fra accuratezza del risultato e velocità dell'analisi. Il futuro dovrà dunque portare programmi (e computer!) in grado di gestire una gran mole di informazioni in parallelo e in tempo reale. I calcolatori quantici sono già all'orizzonte e potrebbero forse essere la risposta.