Ogni qualvolta si prepara una sequencing library le precoccupazioni principali sono: 1) ottenere un livello di complessità adeguato (vedi sotto), 2) ridurre al minimo gli errori e i bacth effects. Ma andiamo con ordine.
COMPLESSITÀ ED ERRORI
Per complessità di una sequencing library si intende il numero di volte che una read risulta duplicata (in gergo tecnico si parla anche di livello di capture: in un sequenziamento NGS di buona qualità la capture è 30x - leggi trenta per o thirty per). È un po' come leggere e rileggere più volte la stessa parola o la stessa frase: più la leggiamo e più siamo sicuri di cosa c'è scritto. Il problema principale è che livelli di complessità maggiore vanno di pari passo con un'aumentata possibilità di errore, sostanzialmente imputabile all'elevato numero di cicli di amplificazione richiesti e di conseguenti errori clonali.
Non solo: se stabilire ed ottenere un livello predefinito ed uniforme di complessità per una libreria di DNA è relativamente facile (poiché i frammenti di partenza sono presenti in quantità sostanzialmente equimolari), ben più difficile è riuscire a raggiungere un livello di complessità uniforme per le librerie di RNA, dato che, come è noto, a seconda del tipo cellulare, geni diversi vengono espressi o silenziati in maniera diversa. Una libreria con complessità disomogenea, oltre agli errori clonali da PCR, può porre notevoli problemi di amplificazione preferenziale, a causa della quale alcuni frammenti, essendo presenti in quantità iniziali maggiori, vengono amplificati in modo abnorme a discapito di altri, che vanno così perduti.
BATCH EFFECTS
Per batch effects (effetti di gruppo) si intendono tutti quegli effetti dovuti a modificazioni seriali nella lavorazione o nell'analisi che possono inficiare la qualità o l'accuratezza del risultato finale in interi gruppi di campioni. Ne sono un esempio i batch effects generati da errori o modificazioni nella conservazione dei campioni, nel pipettaggio (ad esempio per uso di pipette non tarate), nel settaggio dei termociclatori, nell'uso dei protocolli e persino quelli dovuti al lavoro alternato di tecnici diversi. Alcuni bacth effects possono persino dipendere da fattori intrinseci del campione, come ad esempio un elevato contenuto in CG (CpG islands), che tende a far slittare le polimerasi e dunque ad impattare il livello di efficienza della PCR.
Esistono comunque diversi modi per limitare al massimo gli errori e i batch effects sopra descritti, pur mantenendo un buon livello di complessità della libreria. Non va inoltre dimenticato che i kit commerciali per la preparazione delle sequencing library sono sempre più numerosi, più efficienti e meno costosi e possono essere impiegati con quantità estremamente variabili di acidi nucleici (fino a livelli scarsissimi di pochi picogrammi). A tale proposito, come detto sopra, va ricordato che partire con una buona quantità di DNA o RNA è comunque auspicabile, poiché ciò consente di ridurre i cicli di amplificazione necessari e quindi la possibilità di errori clonali.
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