SANGER SEQUENCING: LA STORIA COMINCIA DA QUI

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La possibilità di sequenziare parti del genoma umano (e di altri esseri viventi) si è avuta a partire dalle intuizioni di Frederick Sanger, il quale riuscì a mettere a punto un sistema di sequenziamento già nel lontano 1977. Il metodo Sanger è noto anche come metodo a terminatori di catena. Il metodo Sanger si rivelò fin da subito molto efficiente, anche se estrememamente laborioso e legato all'uso di sostanze radioattive. La corsa elettroforetica doveva infatti essere approntata manualmente su un gel di poliacrilamide e i primer di innesco dovevano essere marcati radioattivamente.

Per vedere la prima macchina, cioè il primo sequenziatore automatico, bisognerà aspettare il 1987, quando Applied Biosystem presenterà l'ABI370. L'ABI370 funzionava tramite un rivoluzionario metodo di elettroforesi capillare, basato proprio sui principi del metodo Sanger. Con i primi ABI370 si potevano sequenziare frammenti per un totale di circa 500.000 paia di basi al giorno (output: 500 kb/die), con una lunghezza massima per frammento (o read che dir si voglia) di circa 600 basi. Il primo sequenziatore dell'Applied Biosystem aveva un unico capillare, ma presto seguirono macchine a 16 e 96 capillari. Per intenderci, i sequenziatori ABI sono stati quelli che hanno consentito a Celera (che ne aveva una flotta intera!) di completare il sequenziamento dell'intero genoma nel 2001. Questi sequenziatori sono ancora in produzione. In effetti il sequenziamento Sanger continua a rappresentare il gold standard per l'analisi di geni di piccole o medie dimensioni, per il carrier testing (test del portatore) e come supporto alla Next Generation Sequencing - NGS nella riconferma delle varianti di sequenza identificate (in genere, infatti, ogni mutazione rilevata alla NGS va riconfermata con il metodo Sanger). L'ultimo modello, l'ABI3730xl, ha una output di circa 2,88 Mb al giorno e consente di analizzare reads fino a 900 kb di lunghezza. Il metodo Sanger rimane il più preciso, ma rispetto alla NGS presenta una resa (intesa come numero di basi sequenziabili in un giorno) estremamente inferiore e costi molto più elevati.

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