Cosa è e a cosa serve l'elettroforesi degli acidi nucleici.
L'elettroforesi è una tecnica di laboratorio che consente la separazione di frammenti di DNA (o RNA) in base alla loro grandezza. La tecnica sfrutta il principio della migrazione delle molecole con polarità positiva o negativa in un campo elettrico.
Una molecola di DNA o di RNA possiede una leggera carica negativa per via della presenza dei gruppi fosforici. Il DNA immerso in un mezzo (detto tampone) nel quale scorra una corrente elettrica tenderà perciò a migrare verso il polo positivo.
Esistono due tipi di elettroforesi: elettroforesi su gel ed elettroforesi capillare.
ELETTROFORESI SU GEL
Per fare un'elettroforesi sul gel occorrono una vaschetta dotata di attacchi per elettrodo positivo e negativo, una soluzione tampone (TAE o TBE), un piccolo generatore di corrente elettrica e, naturalmente, un gel.
Il gel può essere a base di agarosio, uno zucchero particolare che si estrae dalle alghe. I gel di poliacrilamide non si usano quasi più (si usavano per lo più nel sequenziamento Sanger prima maniera, prima dell’avvento dei sequenziatori automatici). La percentuale di agarosio da utilizzare (dallo 0,1% al 3%) varia in base alle dimensioni dei frammenti di DNA che si desidera separare (per frammenti di dimensioni piccole si impiega una percentuale di agarosio inferiore, in modo che la matrice più rarefatta permetta uno scorrimento più agile delle bande di DNA). Nella sua preparazione il gel allo stato liquido viene versato in uno stampo sul quale viene appoggiato uno speciale pettine che forma dei piccoli pozzetti, all’interno dei quali poi verrà poi pipettato il DNA. Alla miscela del gel viene aggiunta una piccola quantità di una sostanza che si lega al DNA consentendone la visualizzazione in condizioni speciali (ad esempio al buio con retroilluminazione UV). La sostanza da sempre più usata è l’etidio bromuro che, purtroppo, è un mutageno. Da qualche tempo, tuttavia, è in uso anche il SYBR Green che, sebbene più costoso dell’etidio bromuro, non è cancerogeno. Curiosamente, i gel di elettroforesi sono frequentissimamente rappresentati in forme artistiche e specialmente nella televisione e nel cinema a simboleggiare (spesso a sproposito) lo studio e il sequenziamento del DNA (persino nelle analisi identificative di persone l’elettroforesi su gel è stata abbandonata in favore dell’elettroforesi capillare).
Una volta pronto e raffreddato, il gel viene depositato nella vaschetta da elettroforesi, previamente riempita con la soluzione tampone, e collegata al generatore elettrico.
Prima di essere pipettato all’interno dei pozzetti, il DNA o, più precisamente, gli amplificati di DNA ottenuti dalla PCR vengono mescolati con una sostanza colorante (blu di bromofenolo). Il blu di bromofenolo favorisce la precipitazione del DNA in fondo al pozzetto e ne consente la visualizzazione nel gel durante la corsa.
Un volta “caricato” il gel (cioè una volta che il DNA è stato pipettato nei pozzetti), si accende il generatore di corrente e la corsa dei frammenti ha inizio.
È bene ricordare che nel primo pozzetto del gel va caricata la cosiddetta ladder (detta anche marcatore), cioè una miscela di frammenti di DNA di varie dimensioni note che, separandosi durante la corsa elettroforetica, creano una scala di valutazione per il dimensionamento approssimativo gli amplificati.
Una molecola di DNA o di RNA possiede una leggera carica negativa per via della presenza dei gruppi fosforici. Il DNA immerso in un mezzo (detto tampone) nel quale scorra una corrente elettrica tenderà perciò a migrare verso il polo positivo.
Esistono due tipi di elettroforesi: elettroforesi su gel ed elettroforesi capillare.
ELETTROFORESI SU GEL
Per fare un'elettroforesi sul gel occorrono una vaschetta dotata di attacchi per elettrodo positivo e negativo, una soluzione tampone (TAE o TBE), un piccolo generatore di corrente elettrica e, naturalmente, un gel.
Il gel può essere a base di agarosio, uno zucchero particolare che si estrae dalle alghe. I gel di poliacrilamide non si usano quasi più (si usavano per lo più nel sequenziamento Sanger prima maniera, prima dell’avvento dei sequenziatori automatici). La percentuale di agarosio da utilizzare (dallo 0,1% al 3%) varia in base alle dimensioni dei frammenti di DNA che si desidera separare (per frammenti di dimensioni piccole si impiega una percentuale di agarosio inferiore, in modo che la matrice più rarefatta permetta uno scorrimento più agile delle bande di DNA). Nella sua preparazione il gel allo stato liquido viene versato in uno stampo sul quale viene appoggiato uno speciale pettine che forma dei piccoli pozzetti, all’interno dei quali poi verrà poi pipettato il DNA. Alla miscela del gel viene aggiunta una piccola quantità di una sostanza che si lega al DNA consentendone la visualizzazione in condizioni speciali (ad esempio al buio con retroilluminazione UV). La sostanza da sempre più usata è l’etidio bromuro che, purtroppo, è un mutageno. Da qualche tempo, tuttavia, è in uso anche il SYBR Green che, sebbene più costoso dell’etidio bromuro, non è cancerogeno. Curiosamente, i gel di elettroforesi sono frequentissimamente rappresentati in forme artistiche e specialmente nella televisione e nel cinema a simboleggiare (spesso a sproposito) lo studio e il sequenziamento del DNA (persino nelle analisi identificative di persone l’elettroforesi su gel è stata abbandonata in favore dell’elettroforesi capillare).
Una volta pronto e raffreddato, il gel viene depositato nella vaschetta da elettroforesi, previamente riempita con la soluzione tampone, e collegata al generatore elettrico.
Prima di essere pipettato all’interno dei pozzetti, il DNA o, più precisamente, gli amplificati di DNA ottenuti dalla PCR vengono mescolati con una sostanza colorante (blu di bromofenolo). Il blu di bromofenolo favorisce la precipitazione del DNA in fondo al pozzetto e ne consente la visualizzazione nel gel durante la corsa.
Un volta “caricato” il gel (cioè una volta che il DNA è stato pipettato nei pozzetti), si accende il generatore di corrente e la corsa dei frammenti ha inizio.
È bene ricordare che nel primo pozzetto del gel va caricata la cosiddetta ladder (detta anche marcatore), cioè una miscela di frammenti di DNA di varie dimensioni note che, separandosi durante la corsa elettroforetica, creano una scala di valutazione per il dimensionamento approssimativo gli amplificati.
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| Fig. 1: Rappresentazione schematica di elettroforesi su gel. Nella prima corsia a sinistra la ladder (o marcatore), in tutte le altre corsie: i campioni di DNA hanno percorso una distanza diversa, a seconda della loro dimensione. In alto i pozzetti. |
ELETTROFORESI CAPILLARE
L’elettroforesi capillare (in inglese capillary electrophoresis - CE) sfrutta sempre il principio della migrazione del DNA in un campo elettrico. Invece del gel di agarosio viene impiegato un polimero. Il polimero viene pompato in un capillare sottilissimo. Gli amplificati di DNA da dimensionare vengono preparati in modo da incorporarvi dei fluorocromi che li rendano visibili al laser di un sequenziatore automatico. Gli amplificati vengono quindi caricati su una piastra, dalla quale il DNA viene richiamato a scorrere all’interno dei capillari fino ad incrociare la luce del laser.
L’elettroforesi capillare viene utilizzata sia per il dimensionamento allelico (cioè per determinare la grandezza di uno o più amplificati, analogamente a quanto si fa con l’elettroforesi più gel, ma in modo assai più preciso) sia per il sequenziamento (sequenziamento Sanger). Il sequenziamento è reso possibile dal fatto che l’elettroforesi capillare consente di separare frammenti che differiscono di un solo nucleotide.
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