MACCHINE PER L'EXOME SEQUENCING: ILLUMINA

La regione codificante (cioè la parte del DNA che codifica per le proteine, comunemente detta anche esoma) rappresenta solo il 2% di tutto il genoma umano, ma ben l'85% delle mutazioni-malattia cadono proprio in questa regione. Il sequenziamento dell'esoma (exome sequencing) è dunque una tecnica d'elezione per lo studio delle malattie genetiche, specialmente laddove il gene associato alla malattia non sia ancora stato identificato (leggi anche l'articolo specifico sull'exome sequencing).

I sequenziatori in grado di eseguire un exome sequencing sono prodotti da una manciata di grosse ditte che, oltre alla macchina, forniscono una serie di kit e servizi aggiuntivi per (1) preparare la sequencing library, (2) completare la fase di target enrichment e (3) fare l'analisi bioinformatica finale.

Oggi l'azienda leader del settore è probabilmene Illumina, anche se altri grossi rivali le contendono il primato con offerte tecnologiche d'avanguardia (Life Technologies, Pacbio RS, Complete Genomics, ecc). 

Illumina produce tre differenti tipi di sequenziatore. La scelta del modello ideale dipende sostanzialmente dal tipo di analisi che si intende eseguire (ricerca o diagnostica) e dal numero di campioni che devono essere analizzati (i laboratori di ricerca necessitano solitamente di macchinari molto potenti in grado di analizzare numerosi campioni in parallelo, mentre i laboratori di diagnostica tendono a scegliere apparati ottimizzati per l'analisi di pochi campioni alla volta).

Per sequenziare l'esoma di un elevato numero di campioni in parallelo (da dozzine a centinaia) Illumina consiglia di optare per l'ammiraglia della sua flotta, ossia il poderoso HiSeq 2500. Per completare non più di una dozzina di esomi per volta viene invece consigliato il NextSeq 500, che la casa stessa definisce essere il primo sequenziatore da banco a resa elevata (high-throughput desktop sequencer). Se invece lavorate in un piccolo laboratorio e non avete la necessità di far correre più di esoma per volta, il più piccolo MiSeq è la soluzione ideale per voi. È da notare che MiSeq è utile anche per l'esecuzione di pannelli di geni multipli ed è perciò particolarmente adatto ai laboratori di diganostica.

La quantità di DNA necessaria per un exome sequencing con gli strumenti Illumina è piuttosto ridotta: sono infatti sufficienti solo 50 ng. Il tempo per l'allestimento della reazione è pari a circa 30 ore fino ad un massimo di 96 campioni.

Illumina completa l'offerta exome con strumenti avanzati di analisi bioinformatica. Questi strumenti sono delle applicazioni (app) disponibili sulla nuvola e fanno parte del cosiddetto pacchetto BaseSpace. Per il variant calling si possono usare il Burrows-Wheeler Aligner and Genome Analysis Toolkit (BWA/GATK) e il sistema Illumina Isaac, che producono risultati in formato VCF. Per l'annotazione delle varianti si prosegue poi con l'Illumina Annotation Service ed eventualmente con l'applicazione NextBio Research.

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