Come si fa a confermare la diagnosi genetica di sindrome di Angelman?
La diagnosi genetica della sindrome di Angelman richiede non di rado l'esecuzione di un'analisi a più livelli. Andando con ordine i test più indicati sono:
1) TEST DI METILAZIONE. In caso di sospetto clinico di sindrome di Angelman il primo test da eseguire è l'analisi dello stato di metilazione della regione 15q11.2-q13. Uno dei metodi di più diffusi è la Methylation-Specific Multiplex Ligation Probe Amplification (MS-MLPA). MRC-Holland fornisce allo scopo un ottimo kit commerciale (kit SALSA MS-MLPA ME028). La MS-MLPA ha il duplice vantaggio di consentire l'analisi non soltanto dello stato di metilazione, ma anche delle variazioni del numero di copie, permettendo dunque di capire subito se il paziente sia portatore o meno della microdelezione comune. In caso l'MS-MLPA indichi sia l'alterazione dello stato di metilazione che la presenza della microdelezione, lo step successivo sarà l'analisi del cariotipo allo scopo di escludere la presenza di un ulteriore riarrangiamento cromosomico associato alla microdelezione (la presenza o meno di un riarrangiamento cromosomico associato influenza significativamente il calcolo del risch io riproduttivo nelle gravidanze successive).
Altre metodiche per l'analisi dello stato di metilazione includono la PCR dopo trattamento del DNA al bisolfito (detta anche methylation-speicific PCR) e il Southern Blot. Tramite queste metodiche, tuttavia, non è possibile analizzare la variazione del numero di copie e, in caso di positività, si rende dunque necessario procedere allo studio con FISH o array CGH per la ricerca della microdelezione comune.
2) ANALISI DELL'UPD. Nel caso in cui la MS-MLPA o il test al bisolfito confermino uno stato di alterazione del pattern di metilazione, ma la FISH o l'array CGH (o la MS-MLPA stessa) escludano la presenza della microdelezione della regione 15q11.2-q13, si può passare subito al test dell'UPD. Il test dell'UPD può essere condotto tramite l'analisi di SNP e sarà mirato ad identificare l'origine parentale dei cromosomi 15 del probando. A questo scopo sono necessari anche il DNA del padre e della madre. Se lo stato di UPD viene confermato, sarà necessario procedere anche in questo caso allo studio del cariotipo, per verificare che l'UPD non sia dovuta ad un riarrangiamento cromosomico, come ad esempio una traslocazione Robertsoniana 15:15. Verificare la presenza di un riarrangiamento cromosomico associato a UPD è importantissimo per calcolare il rischio riproduttivo (in caso di traslocazione Robertsoniana 15:15, ad esempio, il rischio riproduttivo per il genitore portatore della traslocazione è del 100%!). Nota bene: l'analisi di SNP può identificare un sottotipo particolare di UPD detto isodisomia uniparentale, ma non può identificare tutti i casi di UPD.
3) SEQUENZIAMENTO E ANALISI DI DELEZIONE/DUPLICAZIONE DEL GENE UBE3A. Se il test di metilazione è negativo, si procederà allora all'analisi diretta del gene UBE3A, sia tramite sequenziamento dell'intera regione codificante che tramite test di delezione/duplicazione. Si noti bene che per eseguire un test di delezione/duplicazione completo del gene UBE3A è necessario utilizzare un kit diverso da quello della MS-MLPA utilizzato al punto 1. Il kit MS-MLPA di MRC-Holland contiene infatti solo un numero limitato di sonde per il gene UBE3A. Per poter analizzare la variazione del numero di copie di tutti gli esoni di UBE3A è necessario utilizzare un'altro kit (kit SALSA MLPA P336).
Se tutti e tre gli step sopra indicati sono negativi, si può ipotizzare:
1) un imprinting defect (ID) consistente in una modificazione epigenetica non evidenziabile dalle tecniche diagnostiche di routine.
2) una mutazione genetica in un gene o in una regione cromosomica non nota
3) una diagnosi clinica alternativa a quella di sindrome di Angelman
Per approfondire:
Per approfondire:
Nessun commento:
Posta un commento