POLYPHEN/POLYPHEN2

Polyphen, ora più noto nella sua versione Polyphen2, è un software per l'analisi in silico di mutazioni missenso (cioè di mutazioni che inducono una sostituzione aminoacidica). Il programma effettua delle predizioni sul possibile impatto della mutazione sulla base (1) della sequenza proteica, (2) dell'informazione filogenetica e (3) dell'informazione strutturale. Il programma verifica se la mutazione ricada all'interno di un dominio proteico essenziale per la formazione della struttura secondaria e terziaria della proteina o per il legame con altre molecole. Polyphen2 controlla anche l'insieme delle proteine omologhe per vedere se la stessa mutazione sia stata osservata anche in altre proteine della stessa famiglia. 

Argomenti correlati:

• FILTERING & ANNOTATION: L'ULTIMA FASE DELL'ANALISI BIOINFORMATICA
• ANALISIIN SILICO: CHE COSA È?

PROVEAN

PROVEAN (PROtein Variation Effect ANalyzer) è un software per l'analisi in silico di mutazioni missenso (o mutazioni indel che inducano una sostituzione aminoacidica). Lo scopo di PROVEAN è quello di calcolare il possibile impatto della mutazione sulla funzionalità della proteina. PROVEAN è ospitato, insieme a SIFT, sul sito del J Craig Venter Institute, dove si dichiara che la funzionalità del software è sovrapponibile a quella di altri programmi simili come Polyphen2. Sul sito è disponibile anche una variante denominata PROVEAN HUMAN GENOME VARIANTS, che consente di fare l'analisi delle varianti tramite PROVEAN e SIFT in contemporanea.

Argomenti correlati:

• FILTERING & ANNOTATION: L'ULTIMA FASE DELL'ANALISI BIOINFORMATICA
• ANALISI IN SILICO: CHE COSA È?

SNPeffect

SNPeffect è un programma di filtering e annotation specificamente studiato per fare predizioni sul possibile effetto di una mutazione missenso (cioè di una variante nucletodica che induce una sostituzione aminoacidica nella catena proteica). SNPeffect funziona interrogando il database UniProtKB, dove sono attualmente consevate informazioni su più di 60.000 varianti proteiche. SNPeffect si basa su tre algortmi: TANGO (che rileva regioni prone all'aggregazione), WALTZ (che calcola la tendenza di una certa regione a produrre sostanza amiloide, cioè materiale proteico a ridotto peso molecolare e insolubile) e LIMBO (che predice i siti di legame - binding sites - per gli chaperones Hsp70).

Argomenti correlati:

• FILTERING& ANNOTATION: L'ULTIMA FASE DELL'ANALISI BIOINFORMATICA
• ANALISI IN SILICO: CHE COSA È?

SIFT

SIFT (Sorting Tolerant From Intolerant) è un programma per l'analisi in silico di mutazioni missense il cui scopo è quello di predire la possibile patogenicità di una variante sulla base del livello di conservazione evolutiva del residuo aminoacidico colpito. L'algoritmo di SIFT si basa sul presupposto che i residui aminoacidici maggiormente conservati nell'evoluzione siano verosimilmente i più importanti dal punto di vista funzionale e che mutazioni che affliggono questi residui abbiano dunque maggiori possibilità di essere patogene. Va tuttavia ricordato che una predizione di SIFT, così come qualsiasi altra predizione in silico, può anche essere errata: non sono rari i casi di mutazioni che in silico appaiono patogene mentre in realtà sono neutrali (e viceversa).

SIFT è ospitato sul sito internet del J Craig Venter Institute, dove è disponibile anche un altro programma per l'analisi in silico: PROVEAN.

Argomenti correlati:

• FILTERING & ANNOTATION: L'ULTIMA FASE DELL'ANALISI BIOINFORMATICA
• ANALISI IN SILICO: CHE COSA È?

SEATTLESEQ

SeattleSeq è una programma di filtering e annotation che integra i risultati di altri programmi e database allo scopo di produrre predizioni su varianti genetiche nuove e conosciute. SettaleSeq produce punteggi relativi al grado di conservazione evolutiva delle regione genomica coinvolta, riporta la predizioni di Polyphen e i riporta i dati riguardo la frequenza HapMap. Fra gli altri, SeattleSeq rè in grado di interrogare dbSNP attraverso il Genome Variation Sever.

Argomenti correlati: 

• FILTERING & ANNOTATION: L'ULTIMA FASE DELL'ANALISI BIOINFORMATICA

VARIANT

VARIANT (VARIant ANalysis Tool) è una piattaforma web-based studiata per interrogare diversi database pubblici in parallelo. VARIANT è infatti in grado di eseguire filtering e annotation sondando database come dbSNP, 1000 Genomes, the GWAS catalog, OMIM e COSMIC.

Argomenti correlati:

• FILTERING & ANNOTATION: L'ULTIMA FASE DELL'ANALISI BIOINFORMATICA

VAAST

VAAST (Variant Annotation Analysis and Search Tool) è un programma di filtering e annotation che utilizza informazioni esistenti circa varianti patogene già caratterizzate per fare predizioni su nuove varianti. Il risultato viene restituito in termini di probabilità di patogenicità. A differenza di altri software di filtering e annotation, VAAST è in grado di fare predizioni anche su varianti che cadono in regioni non codificanti.

Argomenti correlati: 

• FILTERING & ANNOTATION: L'ULTIMA FASE DELL'ANALISI BIOINFORMATICA

VAR-MD

VAR-MD è un programma di filtering & annotation ottimizzato per lo studio delle malattie a trasmissione mendeliana. Il software analizza le varianti genetiche ottenute da Whole Genome Sequencing (WGS) o Whole Exome Sequencing (WES) in diversi membri di una stessa famiglia (pedigree), restituendo una lista finale di possibili mutazioni patogene sulla base del modello di ereditarietà più probabile nel caso in questione, sella qualità dei genotipi ottenuti e della frequenza allelica.

Argomenti correlati:

• FILTERING& ANNOTATION: L'ULTIMA FASE DELL'ANALISI BIOINFORMATICA

ANALISI DELEZIONE/DUPLICAZIONE SU DATI NGS

L'analisi delezione/duplicazione - detta spesso anche analisi delle CNV (Copy Number Variation) -si fa di solito tramite l'utilizzo di metodiche specifiche come la MLPA (Multiplex Ligation Probe Amplification), la qPCR (quantitative qPCR) o, per delezioni/duplicazioni particolarmente grandi, la FISH (Flourescence In Situ Hybridization). Oggi però è possibile fare il test delezione/duplicazione anche esaminando esclusivamente i dati del sequenziamento, quando questo sia fatto con la NGS (Next Generation Sequencing).

LRG: LOCUS REFERENCE GENOMICS

LRG Locus-Reference-Genomic è un database il cui scopo è quello di raccogliere sequenze e varianti ben note e sopratutto stabili, cioè talmente ben caratterizzate da non essere suscettibili di essere ulteriormente aggiornate. Lo scopo di LRG è quello di ovviare alla confusione che a volte nasce nel confronto di diversi database, dove la nomenclatura di una stessa sequenza può essere differente e fra i quali gli aggiornamenti non sempre vengono propagati in modo costante o completo. Al momento in cui questo articolo viene scritto LRG contiene solo 700 sequenze. Le sequenze di questo database sono siglate con le iniziali LRG. Se disponibile, Ensembl solitamente riporta per ogni sua sequenza il corrispondente numero LRG.

Per saperne di più:

• REFERENCE SEQUENCE, CONTIG, SCAFFOLD, ASSEMBLY, REFSEQ, ENSEMBL, UCSC: INTRODUZIONE A TERMINI E STRUMENTI BIOINFORMATICI
• RefSeq, IL DATATBASE DELLE SEQUENZE DI RIFERIMENTO
• GenBank E LA DIFFERENZA FRA GenBank E RefSeq
• ENSEMBL
• UCSC GENOME BIOINFORMATICS
• DDBJ: DNA DATABANK OF JAPAN
• LRG: LOCUS REFERENCE GENOMICS

DDBJ: DNA DATABANK OF JAPAN

Il DNA Databank of Japan fa parte del consorzio International Nucleotide Sequence Database Collaboration - INSDC), del quale fanno part anche lo EMBL e il GenBank di NCBI. Lo scopo del consorzio è quello di raccogliere sottomissioni multiple da laboratori indipendenti di tutto il mondo e da diversi progetti di ricerca allo scopo di creare un database di sequenze genetiche. Come spiegato nella lezione su RefSeq, le sequenze contenute in GenBank e in DDBJ presentano livelli di validazione diversi e non sempre possono dunque considerarsi sequenze di riferimento vere e proprie. Le sequenze di riferimento sono quelle contenute in RefSeq. La consultazione di DDBJ non è proprio facilissima. Ad esempio, è difficile ottenere sequenze inserendo semplicemente il simbolo del gene. Di solito è necessario sfruttare altre sigle, come ad esempio i codici di GenBank.

Per saperne di più:

• REFERENCE SEQUENCE, CONTIG, SCAFFOLD, ASSEMBLY, REFSEQ, ENSEMBL, UCSC: INTRODUZIONE A TERMINI E STRUMENTI BIOINFORMATICI
• RefSeq, IL DATATBASE DELLE SEQUENZE DI RIFERIMENTO
• GenBank E LA DIFFERENZA FRA GenBank E RefSeq
• ENSEMBL
• UCSC GENOME BIOINFORMATICS
• LRG: LOCUS REFERENCE GENOMICS

UCSC GENOME BIOINFORMATICS

Lo UCSC Genome Bioinformatics è un database creato e curato dalla University of California Santa Cruz (da cui il nome UCSC). UCSC contiene sequenze di genomi, trascritti e proteine. Alcune possono considerarsi sequenze di riferimento, mentre altre sono solo delle bozze. Le sequenze contenute nello UCSC possono anche corrispondere a sequenze contenute in altri database come quelli dell’NCBI (RefSeq, ad esempio). Per queste sequenze, UCSC fornisce una tabella che ne consente l’identificazione (la tabella è consultabile a questa pagina). Ad esempio, per quanto riguarda gli assembly dell’intero genoma umano, l’assembly hg18 corrisponde al NCBI build 36.1, mentre l’hg8 è un assemblato prodotto direttamente dallo UCSC (UCSC-assembled).

UCSC non è solo un database, ma un insieme di strumenti bioinformatici interattivi. Fra gli altri, UCSC fornisce infatti:

• Genome Browser, che consente di visualizzare geni o porzioni di cromosomi;

• Gene Sorter, che mostra informazioni sull’espressione genica e sull’omologia;

• Blat, che consente di mappare una sequenza nel genoma.

Per saperne di più:

• REFERENCE SEQUENCE, CONTIG, SCAFFOLD, ASSEMBLY, REFSEQ, ENSEMBL, UCSC: INTRODUZIONE A TERMINI E STRUMENTI BIOINFORMATICI
• RefSeq, IL DATATBASE DELLE SEQUENZE DI RIFERIMENTO
• GenBank E LA DIFFERENZA FRA GenBank E RefSeq
• ENSEMBL
• DDBJ: DNA DATABANK OF JAPAN
• LRG: LOCUS REFERENCE GENOMICS

ENSEMBL

Le sequenze di DNA e gli assembly che si trovano in Ensembl provengono da vari progetti in tutto il mondo. Ensembl fornisce, per tutte quelle sequenze che sono depositate anche in RefSeq, la corrispondente nomenclatura RefSeq, così che l’utente possa capire che si tratta della stessa identica sequenza riportata in due diversi database.

Anche in Ensembl, come in RefSeq, sono archiviate sequenze di riferimento di geni, trascritti e proteine. Le sequenze dei geni (sia codificanti per proteine che codificanti per ncRNA che pseudogeni) – sigla ENSG - sono disponibili nella sezione GENCODE, dove è possibile visualizzare l'intera sequenza nucleotidica, all'interno della quale le sequenze esoniche del gene vengono evidenziate in rosso. Eventuali altre regioni esoniche non appartenenti al gene, ma comunque presenti nella regione, sono evidenziate in rosa.

Figura 1 - Esempio di sequenza genica in Ensembl tratta dal gene BRCA2 (in evidenza sequenze esoniche). Riferimento Ensembl: ENSG00000139618.

Poiché le pagine di GENCODE sono interattive, è possibile personalizzare la visualizzazione aggiungendo, ad esempio, le varianti nucleotidiche del gene: basta cliccare su "Configure this page" nel menù sul lato sinistro della pagina.

Venendo ai trascritti – sigla ENST – questi sono molto intelligentemente associati a un gene ENSG (Ensembl riporta infatti la formula: This transcript is a product of gene ENSG.....). Una volta sulla pagina principale di un trascritto ENST è possibile cliccare su "Show Transcript Table" per vedere la lista di tutti i trascritti presenti nel databse Ensembl e individuare subito quali, fra questi, corrispondono a trascritti RefSeq. Similmente, il database contiene anche sequenze proteiche - sigla ENSP.

GenBank E LA DIFFERENZA FRA GenBank E RefSeq

Quando si parla di RefSeq si sente parlare spesso anche di GenBank. Come RefSeq, GenBank è un database dell'NCBI. Anche GenBank è un database di sequenze genetiche, che non sempre però possono considerarsi vere e proprie sequenze di riferimento. GenBank è parte di un consorzio (lo International Nucleotide Sequence Database Collaboration - INSDC), del quale fanno parte anche lo EMBL e il DDBJ, il cui scopo è quello di raccogliere sottomissioni multiple da laboratori indipendenti di tutto il mondo e da diversi progetti di ricerca. I dati di GenBank sono spesso ridondanti, frammentari e possiedono diversi livelli di accuratezza e validazione.

Le sequenze di RefSeq, invece, che possono essere derivate anche ma non solo da GenBank, sono sequenze validate, che sono state cioè "curate" dal team di RefSeq sulla base di diversi database e con l’ausilio della letteratura allo scopo di produrre delle sequenze “di riferimento” per l’uso quotidiano nella ricerca e, soprattutto, nella diagnostica di routine.

Per saperne di più:

• RefSeq, IL DATATBASE DELLE SEQUENZE DI RIFERIMENTO
• ENSEMBL
• UCSC GENOME BIOINFORMATICS
• DDBJ: DNA DATABANK OF JAPAN
• LRG: LOCUS REFERENCE GENOMICS

RefSeq: IL DATATBASE DELLE SEQUENZE DI RIFERIMENTO

Come anticipato nell'introduzione ai termini e agli strumenti bioinformatici, in RefSeq sono contenute sequenze di riferimento di geni, trascritti e proteine. È da osservare anzitutto come il termine RefSeq sia in realtà solo il nome formale. Di fatto RefSeq è suddiviso in più database. Per ottenere la sequenza di un gene, infatti, bisognerà interrogare Gene, per ottenere una lista di trascritti bisognerà effettuare la ricerca in Nucleotide, mentre per ottenere la sequenza della proteina bisognerà interrogare Protein. Fanno parte di RefSeq anche alcuni progetti, a volte dalla descrizione non molto chiara. Si tratta dei cosiddetti RefSeq projects: RefSeqGene (in realtà ogni ricerca effettuata qui reindirizza a Gene), Consensus CDS, HIV-1 Human Interaction Database, Targeted Loci (un progetto mirato a raccogliere informazioni su geni codificanti per proteine o RNA ribosomiali che possano essere utilizzati nell’analisi filogenetica) e Virus Variation.

Tutte le reference sequences del database sono identificate da due lettere iniziali. Vediamo subito le più importanti:

• NC_ → identifica la sequenza di riferimento di un intero genoma (assembly)

• NM_ → identifica la sequenza di riferimento di un trascritto

• NP_ → identifica la sequenza di riferimento di una proteina

Nella diagnostica genetica di routine NC_ e NP_ non sono poi molto utilizzati (sebbene possano essere codici di riferimento di estrema utilità in un contesto di ricerca). Le sequenze di riferimento più spesso utilizzate in diagnostica sono infatti le sequenze NM_, cioè quelle che identificano un trascritto. Infatti, come del resto raccomandato dalla Human Genome Variation Society (HGVS), le mutazioni vengono più comunemente descritte a livello del cDNA, ossia del trascritto (NM_). È da notare che ogni NP_ (proteina) è associata a una NM_ (infatti, se codificante, ad ogni trascritto corrisponde una determinata proteina) e a una NC_ (infatti, potendo le sequenze di un gene variare leggermente da un assembly all’altro, possono variare leggermente anche le sequenze dei trascritti).

Esistono poi altre sigle, di uso meno frequente. A livello genomico (ossia a livello del DNA) si distinguono:

• AC_: identifica anche questa un intero genoma, che però non è solitamente quello di riferimento, bensì uno alternativo;
• NG_: identifica soltanto una regione genomica incompleta;
• NT_ e NW_: identifica un contig (contiguo) o uno scaffold (impalcatura, cioè un insieme di contigui). Identifica dunque solo una piccola porzione dell’intero genoma. NT_ identifica contig o scaffold ricostruiti con la metodica del clonaggio o dello Whole-Genome Sequencing (WGS), mentre NW_ rappresenta un contig o uno scaffold costruito primariamente con un WGS;
• NS_: è una sequenza cosiddetta ambientale, ottenuta cioè dal sequenziamento di campioni prelevati nell’ambiente;
• NZ_: è una sequenza prodotta da un WGS, ma incompleta.

A livello di trascritto (ossia a livello del cDNA) e delle proteine si hanno poi:

• NR_: identifica un RNA (non un mRNA);
• XM_: identifica un mRNA, ma solo secondo un modello di predizione. Non si tratta dunque di una sequenza revisionata e confermata del team di RefSeq. Similarmente si basano su modelli di predittivi le sequenze proteiche XP_ (ciascuna delle quali associata a una sequenza XM_) e le sequenze XR_ (RNA e non mRNA);
• AP_ , cioè una sequenza proteica alternativa annotata sulla base di un assembly alternativo AC_;
• ZP_, cioè una sequenza proteica alternativa basata su un assembly WGS incompleto NZ_;
• YP_, altra sigla che identifica genericamente una predizione di sequenza proteica.

Un’utile tabella riassuntiva su tutte le sigle utilizzate in RefSeq è disponibile sul sito RefSeq cliccando qui.

Parlando di RefSeq si sente spesso parlare anche di GenBank, ma le due cose sono differenti: per saperne di più clicca qui.

REFERENCE SEQUENCE, CONTIG, SCAFFOLD, ASSEMBLY, REFSEQ, ENSEMBL, UCSC: INTRODUZIONE A TERMINI E STRUMENTI BIOINFORMATICI

Chi si occupa di genetica sa che l’utilizzo dei database bioinformatici (e la terminologia in essi utilizzata) non è sempre facile e che, specialmente all'inizio, richiede un certo periodo di training. Ecco di seguito una breve introduzione ad alcuni dei termini e delle risorse bioinformatiche più utilizzate.

REFERENCE SEQUENCE

Come già spiegato in COS’È UNA REFERENCE SEQUENCE, per ogni gene, trascritto e proteina esistono nelle banche dati una o più sequenze di riferimento (reference sequences). Le reference sequences dei database rappresentano le sequenze tipo dell’uomo, con le quali le sequenze di un paziente specifico vengono messe a confronto allo scopo di identificare eventuali mutazioni patogene.

CONTIG, SCAFFOLD, ASSEMBLY

Poiché non è possibile sequenziare le molecole di DNA nella loro interezza, l’unico modo per ricostruire un gemona umano è quello di frammentare a caso il DNA in tanti piccoli pezzetti di dimensioni tali da poter essere sequenziati (shotgun sequencing). I prodotti del sequenziamento, le cosiddette reads, vengono poi riassemblate come in un puzzle sfruttando le regioni di sovrapposizione alle estremità di ciascuna read. Dall’allineamento delle reads si ottengono quindi delle sequenze più lunghe, dette contigui (o contig), i quali vengono a loro volta riuniti in sequenze di dimensioni ancora maggiori dette scaffold. Gli scaffold vengono ulteriormente allineati fino a costruire un assemblato finale (assembly). Un assembly genomico, dunque, non è altro che un genoma completo. Si badi bene, tuttavia, che non esistono solo assembly genomici, ma anche assembly di soli trascritti, detti EST assembly, nei quali si rappresenta soltanto la parte trascritta del genoma: per saperne di più puoi leggere anche EST - EXPRESSED SEQUENCE TAG).

BANCHE DATI BIOINFORMATICHE (DATABASE)

I database più utilizzati per reperire sequenze di riferimento sono RefSeq (prodotto da NCBI), Ensembl (prodotto da EMBL-EBI e da Wellcome Trust Sanger Institute) e UCSC Genome Bioinformatics (prodotto dalla University of California Santa Cruz). Meno conosciuto è il DDBJ (DNA Databank of Japan, dall'utilizzo apparentemente un po' ostico, ma importante perché facente parte del consorzio International Nucleotide Sequence Database Collaboration - INSDC). Forse ancor meno conosciuto, per ora, è lo LRG (Locus Reference Genomics, il cui contenuto è ancora limitato).

Per saperne di più:

• RefSeq, IL DATATBASE DELLE SEQUENZE DI RIFERIMENTO
• ENSEMBL
• UCSC GENOME BIOINFORMATICS
• DDBJ: DNA DATABANK OF JAPAN
• LRG: LOCUS REFERENCE GENOMICS

MiSeq E OVERLAPPING PAIRED-END READS

Abbiamo visto come nel sequenziamento a paired-end reads le reads ottenute a partire dalle due estremità dei frammenti della sequencing library non siano né complementari né sovrapponibili, ma restino separati da un tratto di sequenza di DNA dalla grandezza nota, definito in gergo inner mate distance. Nel sistema MiSeq di Illumina, tuttavia, la inner mate distance può essere negativa, poiché in questo sistema le paired-end reads possono sovrapporsi.

SINGLE-END READS E PAIRED-END READS

Reindirizzamento alla versione aggiornata in corso, attendere prego...

Un sequenziamento NGS può essere fatto utilizzando single-end reads o paired-end reads. Come già visto nella lezione COSA È UNA READ?, una read è una corta sequenza di DNA di sintesi che viene prodotta durante la reazione di sequenziamento.

COS' È UNA READ?

Reindirizzamento alla versione aggiornata in corso, attendere prego...
Se il reindirizzamento non avviene ntro 5 secondi, per favore cliccare qui.

Sequenziamento: cosa sono le reads? Solo apparentemente complesso, il concetto di read può essere spiegato facilmente.

Una read è una piccola sequenza di DNA di sintesi che si ottiene in una reazione di sequenziamento. Il sequenziamento può essere fatto essenzialmente seguendo uno dei seguenti due principi: (1) chromosome walking: la reazione procede in modo ordinato lungo il cromosoma, (2) shotgun sequencing: vengono amplificati e sequenziati pezzi a caso del genoma, che vongono poi riallineati con operazioni di alignment.

IL FUTURO DELL'ANALISI BIOINFORMATICA

Vista la sempre crescente capacità di output dei sequenziatori (che arriva ormai ai miliardi di basi a corsa), abbiamo già detto come una delle maggiori sfide del futuro sia costituita dall'analisi bioinformatica. L'enorme potenza di calcolo richiesta costringe già oggi a dover scegliere, in alcuni casi, fra accuratezza del risultato e velocità dell'analisi. Il futuro dovrà dunque portare programmi (e computer!) in grado di gestire una gran mole di informazioni in parallelo e in tempo reale. I calcolatori quantici sono già all'orizzonte e potrebbero forse essere la risposta.